本文來源：中國中藥雜志， 2017年17期 ：補體抑制活性物質(zhì)魚腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除，如需刪除請留意，謝謝。

[關(guān)鍵詞]

魚腥草總多糖、內(nèi)毒素、顯色法基質(zhì)鱟試劑盒、廈門鱟試劑、 抗補體、 疏水色譜、親和吸附色譜

[背景]

魚腥草Houttuynia Herba為三白草科Saururaceae蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的新鮮全草和干燥的地上部分，具有利尿通淋、抗炎抗過敏、增強機體免疫力等功效[13]。補體系統(tǒng)（complement system）是將對病原體的識別有效地轉(zhuǎn)化為宿主對最初感染發(fā)揮防御功能的主要機制之一。補體的過度激活會引起人體免疫系統(tǒng)的過度反應(yīng)，參與多種疾病的病理過程[4]，臨床上目前尚無理想的治療藥物。近年來，本課題組致力于中藥補體抑制劑的研究，分離得到了一些高效、低毒的小分子化合物及大分子多糖類天然補體抑制劑[58]。其中，魚腥草總多糖抗補體活性較強[9]，同時具有顯著的解熱和防治內(nèi)毒素（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷藥效[1011]，臨床開發(fā)應(yīng)用前景良好。

[摘要]

本實驗通過柱色譜聯(lián)用去除魚腥草總多糖中的LPS，以顯色基質(zhì)比色法定量檢測內(nèi)毒素含量，比較疏水色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用及凝膠過濾色譜與親和吸附色譜的聯(lián)用對LPS的清除率，同時比較LPS清除前后魚腥草總多糖體外補體抑制活性的變化，為中藥活性多糖藥物中LPS的去除提供方法參考。

以下為部分實驗內(nèi)容分享，如需閱讀全文請與我司業(yè)務(wù)員聯(lián)系。

1 材料

魚腥草，經(jīng)鑒定為三白草科Saururaceae 蕺菜屬植物蕺菜H. cordata的干燥地上部分。魚腥草總多糖為采用課題組前期優(yōu)化工藝自制[9]。endprint

LPS對照品（Pharmacia Biotech）；顯色基質(zhì)法鱟試劑盒；透析袋。氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸及苯酚均為國產(chǎn)AR級，苯酚用前重熏。

廈門鱟試劑生物科技股份有限公司顯色基質(zhì)鱟試劑盒

電子天平，TDL4型低速臺式離心機，Well scan MK3型酶標(biāo)儀，EYELAOSB2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，精達(dá)水浴恒溫振蕩器，RLPHR 12 LD型冷凍干燥器，UV759S 紫外可見分光光度計，HL2S型橫流泵，BSZ100型自動部分收集儀。

2 方法

2.1 顯色基質(zhì)法[21]定量檢測LPS含量

2.1.1 反應(yīng)試劑的配制 按標(biāo)示量加細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解鱟試劑，鱟試劑應(yīng)于溶解后10 min內(nèi)使用。按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水溶解顯色基質(zhì)。按標(biāo)示量加反應(yīng)終止劑HCl配制偶氮化試劑1。按標(biāo)示量加內(nèi)毒素檢查用水溶解偶氮化試劑2，3。

2.1.2 對照品及待測樣品溶液的配制 精密稱取適量對照品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水配制成濃度分別為0.01， 0.025， 0.05， 0.1 EU·mL-1或0.1， 0.25， 0.5， 1.0 EU·mL-1。精密稱取適量待測樣品，加內(nèi)毒素檢查用水配制成待測樣品溶液。

2.1.3 陰性對照品溶液的配制 取100 μL內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液及100 μL待測樣品溶液，加入100 μL細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，混勻，即為陰性對照品溶液。

2.1.4 內(nèi)毒素含量測定方法 取300 μL對照品，加入鱟試劑100 μL，混勻，根據(jù)其內(nèi)毒素濃度范圍分別于37 ℃溫浴45 min或8 min后，加入顯色基質(zhì)溶液100 μL，混勻，37 ℃溫浴6 min，繼續(xù)加入偶氮化試劑1、偶氮化試劑2和偶氮化試劑3溶液各500 μL，混勻靜置5 min，于545 nm下測定其吸光度。

以吸光度值為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。

陰性對照品溶液或待測樣品溶液的內(nèi)毒素濃度測量法同上。

2.1.5 供試品干擾實驗 由于要考察試驗中各因素對鱟試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品反應(yīng)的影響，故需進(jìn)行供試品干擾實驗，計算回收率。回收率計算方式如下：

R=（Cs-Ct）/Cr×100%

Cr：選取靠近內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線中點的濃度；Cs：配制含有內(nèi)毒素濃度為Cr的供試品溶液，其測量所得的內(nèi)毒素濃度值記為Cs；Ct：未添加內(nèi)毒素的供試品所測得的內(nèi)毒素濃度值。

當(dāng)R在50%～200%時，認(rèn)為此實驗條件下對供試品溶液不存在干擾。若R超出此范圍則需進(jìn)一步對供試品進(jìn)行稀釋，重復(fù)供試品干擾實驗至R進(jìn)入50%～200%。一般選擇R接近100%時的供試品濃度進(jìn)行供試品的內(nèi)毒素含量測定。

3 結(jié)果

3.1 內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程的建立

當(dāng)LPS濃度范圍為0.01～0.1 EU·mL-1時，回歸方程為Y=0.872 9X-0.040 9，R2=0.992 8；LPS濃度范圍為0.1～1.0 EU·mL-1時，回歸方程為Y=6.183 1X-0.002 5，R2=0.995 3。

3.2 魚腥草總多糖中內(nèi)毒素的去除

3.2.1 凝膠過濾色譜法與親和吸附色譜法聯(lián)用 將魚腥草總多糖經(jīng)Sephacryl S300柱洗脫后的洗脫液6～10管合并、透析、凍干，記為H1；將H1樣品再次經(jīng)AffiPrep Polymyxin柱純化，其洗脫液的3～5管合并、透析、凍干，記為H1′， 見圖1。

3.2.2 疏水色譜法與親和吸附色譜法聯(lián)用 將魚腥草總多糖經(jīng)Penyl Sepharose 6 FF柱洗脫后的洗脫液6～13管合并、透析、凍干，記為H2；將H2樣品經(jīng)AffiPrep Polymyxin柱洗脫后的3～5管合并、透析、凍干，記為H2′，見圖2。

3.3 供試品干擾實驗

為避免試驗中各因素對鱟試劑、標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品反應(yīng)的影響，對供試品進(jìn)行了干擾實驗，計算回收率，并選擇回收率接近100%時的供試品濃度進(jìn)行供試品的內(nèi)毒素含量測定。魚腥草總多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 79 g·L-1時，回收率為接近100%；H1的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 78 g·L-1時，回收率為接近100%；H1′的質(zhì)量濃度達(dá)到0.001 25 g·L-1時，回收率為接近100%；H2的質(zhì)量濃度達(dá)到0.000 85 g·L-1時，回收率為接近100%；H2′的質(zhì)量濃度達(dá)到0.001 g·L-1時，回收率為接近100%，見表1。

3.4 內(nèi)毒素的含量測定與抗補體活性測定

取魚腥草總多糖及3.2項不同程度純化樣品H1， H1′， H2， H2′，根據(jù)干擾實驗結(jié)果，分別配置回收率接近100%的各樣品溶液，以2.4項所述方法測定其內(nèi)毒素含量；取上述各樣品按2.5項方法測定抗補體活性CH50。魚腥草總多糖不同方法純化前后的內(nèi)毒素含量及抗補體活性變化結(jié)果見表2。

LPS去除率=（總多糖LPS量-純化片段LPS量）/總多糖LPS量×100%