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LAL試驗(yàn)快速檢測(cè)肉品細(xì)菌污染程度及鮮度的研究

?！≌?王登臨,董瑞鵬,楊紅巖,張　蕾

(甘肅省動(dòng)物檢疫總站,甘肅蘭州730030)

[摘要]
對(duì)不同鮮度的豬肉、牛肉、羊肉、雞肉和魚肉進(jìn)行活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及揮發(fā)性鹽基氮(TVB_N)測(cè)定,并與LAL試驗(yàn)(鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn))進(jìn)行平行對(duì)比研究,證實(shí)肉品的鮮度與其細(xì)菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及LAL指數(shù)呈負(fù)相關(guān)性。應(yīng)用LAL試驗(yàn)可在短時(shí)間(1～ 2小時(shí))內(nèi)快速判定肉品的細(xì)菌污染程度及鮮度,比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)法大大縮短了時(shí)間,適合現(xiàn)場大批量肉品細(xì)菌污染程度及鮮度的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞: 肉品; 細(xì)菌污染; LAL試驗(yàn); 快速檢測(cè)

中圖分類號(hào): S852.61　　 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A　　 文章編號(hào):1008_0589(2002)04_0304_06

Rapid Determination of Bacterial Contamination and Freshness of Meat by LAL TestWUZheng,WANG Deng_lin,DONG Rui_peng,YANG Hong_yan,ZHANG Lei(Gansu Provincial Animal Quarantine Station 730030,China)Abstract: Three different freshness samples of pork,beef,mutton,chicken and fish were examined for the numbers of total viable cells,gram_negative organisms,colifrom groups and the value of TVB_N.The resultswere comparedwith those of LALtest(limulus amoebocyte lysatetest).A positive correlationwas observed among the total viable cells,gram_negative organisms and LALindexes. It indicated that LALtest in-dex can be used to determine the bacterial contamination and freshness of the meat rapidly.

Key words: Meat;Bacterial contamination;LALtest;Rapid determination

肉品的衛(wèi)生質(zhì)量關(guān)系到廣大人民群眾的食肉安全,而肉品細(xì)菌污染程度是反映其衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)。快速準(zhǔn)確檢測(cè)肉品細(xì)菌污染程度及鮮度,保證廣大消費(fèi)者吃上“放心肉”,是動(dòng)物檢疫機(jī)構(gòu)和衛(wèi)生部門亟待解決的問題。目前,國內(nèi)檢測(cè)肉品新鮮度的主要方法是感官鑒定和實(shí)驗(yàn)室揮發(fā)性鹽基氮(TVB_N)測(cè)定。感官鑒定的不足之處是結(jié)果不易量化,存在主觀性和片面性;TVB_N測(cè)定變化有時(shí)不敏感,肉品變質(zhì)程度與肉品中TVB_N含量變化呈非正相關(guān)[1]。肉品細(xì)菌污染程度的檢測(cè)是判定肉品鮮度的一種準(zhǔn)確、客觀的方法,常用的為細(xì)菌活菌總數(shù)培養(yǎng)計(jì)數(shù)法和大腸菌群數(shù)測(cè)定法,但檢驗(yàn)一個(gè)樣品至少需用48小時(shí),費(fèi)時(shí)費(fèi)力,很不適應(yīng)于當(dāng)今快速肉品消費(fèi)市場的檢測(cè)[1]。

細(xì)菌的快速檢測(cè),是指在檢驗(yàn)樣品的過程中,無需進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)等項(xiàng)目的檢驗(yàn),而是利用一定的方法在幾小時(shí)甚至更短的時(shí)間內(nèi)從樣品中直接確定是否有細(xì)菌、細(xì)菌代謝產(chǎn)物存在,定性、定量,以達(dá)到對(duì)細(xì)菌污染程度進(jìn)行判定的目的。國外對(duì)肉品中細(xì)菌快速檢測(cè)已建立了如基因探針檢驗(yàn)、氣相色譜及免疫酶等多種方法,但這些方法主要用于一些特異性病原菌的檢測(cè),很難全面反映肉品細(xì)菌的污染程度,且所需試劑昂貴,設(shè)備要求高,未能得到廣泛應(yīng)用。

肉品細(xì)菌污染主要是由畜禽屠宰加工過程中革蘭氏陰性腸道細(xì)菌所致。革蘭氏陰性細(xì)菌胞壁中含有特殊成分—脂多糖,即為革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素。鱟血細(xì)胞內(nèi)含有可凝蛋白、B因子、凝固酶原等蛋白凝固因子,內(nèi)毒素同鱟試劑反應(yīng)可形成肉眼可見的凝膠。國外學(xué)者已對(duì)利用LAL試驗(yàn)快速檢測(cè)肉品細(xì)菌污染程度進(jìn)行了一些研究[2,3]。國內(nèi)一些研究人員已把LAL試驗(yàn)用于食品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的測(cè)定[4],但在檢測(cè)肉品細(xì)菌污染程度及新鮮度方面的應(yīng)用還未見報(bào)道。

1　材料和方法

1.1　鱟試劑　靈敏度為2EU/ml,由廈門鱟試劑廠提供,批號(hào)為980708和981103。每批使用前按說明用內(nèi)毒素陽性標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定其靈敏度。

1.2　鱟試劑溶解水及稀釋液　鱟試劑溶解水為廈門鱟試劑廠生產(chǎn)的無熱原水;稀釋液為LAL試驗(yàn)檢測(cè)陰性的注射用生理鹽水。

1.3　細(xì)菌培養(yǎng)基及化學(xué)試劑　營養(yǎng)瓊脂、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂均為成品培養(yǎng)基;所用化學(xué)試劑均為分析純級(jí)。

1.4　試驗(yàn)肉品　豬肉:市場采集的一級(jí)鮮度肉28份,二級(jí)鮮度肉2份;人工二級(jí)鮮度肉5份,人工變質(zhì)肉11份;牛肉:市場采集的一級(jí)鮮度肉5份;人工二級(jí)鮮度肉5份,人工變質(zhì)肉3份;羊肉:市場采集的一級(jí)鮮度肉3份;人工二級(jí)鮮度肉3份,人工變質(zhì)肉2份;雞肉:市場采集的一級(jí)鮮度肉6份;人工二級(jí)鮮度肉3份,人工變質(zhì)肉2份;魚肉(淡水魚):市場采集的一級(jí)鮮度肉6份;人工二級(jí)鮮度肉2份,人工變質(zhì)肉2份(人工二級(jí)鮮度和人工變質(zhì)肉是將新鮮肉在室溫下或在37℃恒溫箱內(nèi)放置一定時(shí)間后獲得)。

1.5　LAL試驗(yàn)方法　將鱟試劑安瓿打開,加入0.1ml鱟試劑溶解水使凍干物充分溶解,然后加入等量的待檢肉樣稀釋液,搖勻置37± 0.5℃恒溫水浴鍋中靜置60± 2分鐘,取出后觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照、陽性對(duì)照及抑制對(duì)照。鱟試劑凝固,呈膠凍狀,倒轉(zhuǎn)180度凝塊不變形、不流動(dòng)判為陽性。以出現(xiàn)陽性反應(yīng)的肉樣稀釋液最高稀釋倍數(shù)計(jì)算LAL指數(shù)(為使鱟試劑發(fā)生凝固的肉樣稀釋液10倍稀釋的最高稀釋度指數(shù))及肉毒素含量。

1.6　肉樣處理和稀釋　在肉樣的精瘦肉處,從約4cm2大小范圍內(nèi)由表層向深層取5g肉,置滅菌燒杯中剪碎,加入45ml生理鹽水,放在磁力攪拌器上攪拌10～ 15分鐘,即成1∶10的肉浸液。吸取肉浸液1ml加入裝有9ml生理鹽水的試管中,充分混勻,即成1∶102稀釋液。依據(jù)肉樣新鮮程度(感官判定)依次稀釋至1∶105～ 1∶108。制備的稀釋液同時(shí)用于微生物學(xué)試驗(yàn)及LAL試驗(yàn)。

1.7　新鮮度鑒定及TVB_N測(cè)定　按GB5009.44_85《肉與肉制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)分析方法》進(jìn)行。

1.8　活菌總數(shù)及大腸菌群數(shù)測(cè)定　按GB4789.2_84和GB4789.3_84《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)》進(jìn)行。

1.9　革蘭氏陰性菌數(shù)測(cè)定　選擇3個(gè)稀釋度肉樣稀釋液,接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板,每個(gè)稀釋度接2個(gè)平板,每個(gè)平板接種0.2ml,搖勻后37℃培養(yǎng)48小時(shí),計(jì)數(shù)生長的菌落。

1.10　LAL指數(shù)與細(xì)菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及TVB_N值相關(guān)性對(duì)比分析　按生物統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r),分析LAL指數(shù)與其他試驗(yàn)數(shù)值之間的相關(guān)程度。

2　結(jié)　果

2.1　肉品感官鑒定、TVB_N和微生物學(xué)指標(biāo)測(cè)定及LAL試驗(yàn)　由表1～ 5可見,不同種類、不同新鮮度的肉樣88份,隨著肉品新鮮度的降低,活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及大腸菌群數(shù)對(duì)數(shù)值均相應(yīng)升高,LAL指數(shù)和肉品內(nèi)毒素含量也都相應(yīng)升高;TVB_N值在豬肉、牛肉和羊肉也都出現(xiàn)相應(yīng)變化;不同新鮮度之間的各數(shù)值(除雞魚肉TVB_N值)有顯著差異(p< 0.01)。同等鮮度牛、羊肉TVB_N值、活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)及LAL指數(shù)相近,無顯著差異(p> 0.05);但不同鮮度之間各數(shù)值有顯著的差異(p< 0.01)。因此,牛肉和羊肉可用同一指標(biāo)進(jìn)行判定。

2.2　LAL指數(shù)與活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群及TVB_V值相關(guān)性對(duì)比分析　用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)原理計(jì)算相關(guān)系數(shù)(r),結(jié)果見表6。LAL指數(shù)與活菌總數(shù)、革蘭氏陰性菌數(shù)、大腸菌群數(shù)及TVB_V值的相關(guān)系數(shù)(r)均值分別為0.955、0.948、0.813和0.363;與其相關(guān)性依次為活菌總數(shù)>革蘭氏陰性菌數(shù)>大腸菌群數(shù)> TVB_V值。

參考文獻(xiàn)（略）

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